本指南為通用操作流程，不能替代操作手冊。在進行任何實驗前，請務(wù)必接受相關(guān)培訓(xùn)并仔細閱讀儀器和試劑的使用說明書。整個操作過程需嚴(yán)格遵守?zé)o菌原則，防止RNA/DNA降解和PCR污染。

一、賽默飛QuantStudio3實時熒光定量PCR上機運行

1、開機與初始化

（1）打開電腦、顯示器。

（2）打開QuantStudio 3主機背面的電源開關(guān)。儀器會進行自檢，發(fā)出“嘀"聲，樣品塊會移動。等待自檢完成，樣品塊停止運動后再進行下一步。

2、創(chuàng)建實驗

（1）雙擊桌面上的 “QuantStudio Design & Analysis Software" 圖標(biāo)，啟動軟件。

（2）點擊軟件左上角的 “New Experiment"（新建實驗）。

（3）在彈出的窗口中選擇實驗類型：

Standard Curve (Absolute Quantification)：定量，用于計算拷貝數(shù)。

Comparative ΔΔCt (Relative Quantification)：相對定量，用于計算基因表達差異。

Melt Curve：溶解曲線，通常與SYBR Green法聯(lián)用。

Genotyping：基因分型。

（4）選擇完成后，點擊 “Create"。

3、設(shè)置板子布局

（1）軟件界面會顯示一個虛擬的96孔板。

（2）在左側(cè)的 “Well Inspector" 面板中，為每個孔或一組孔（可拖選）定義屬性：

Sample Name：樣本名稱（如：Sample1, Control等）。

Task：任務(wù)類型（Unknown-待測樣本；NTC-無模板陰性對照；Standard-標(biāo)準(zhǔn)品）。

Reporter：選擇熒光染料（如：FAM, VIC等。SYBR Green通常選SYBR）。

Quencher：選擇對應(yīng)的淬滅基團（如：None, TAMRA等）。

Quantity：如果設(shè)置了標(biāo)準(zhǔn)品，在此處輸入標(biāo)準(zhǔn)品的已知度。

4、運行實驗

（1）將密封好的反應(yīng)板放入儀器樣品槽中，確保板子方向正確（A1孔在左上角）。

（2）在軟件界面右上角，點擊 “Start Run"（開始運行）。

（3）彈出窗口中確認(rèn)實驗名稱、保存路徑和反應(yīng)板類型，然后點擊 “OK"。

（4）儀器將開始運行程序，你可以在軟件界面上實時觀察擴增曲線和熒光信號的變化。

二、賽默飛QuantStudio3實時熒光定量數(shù)據(jù)分析

運行結(jié)束后，軟件會自動分析數(shù)據(jù)。

1、查看擴增曲線

在“Results"頁面下的“Amplification Plot"中查看所有孔的擴增曲線。理想的曲線應(yīng)是“S"型，陰性對照無擴增或Ct值很大（通常>35）。

2、設(shè)置基線閾值

軟件會自動設(shè)置基線和閾值（Threshold），但有時需要手動調(diào)整。確保閾值位于所有擴增曲線的指數(shù)增長期內(nèi)，且與基線區(qū)分明顯。

3、查看結(jié)果

點擊“Plate"選項卡，可以以表格形式查看每個孔的Ct值、起始拷貝數(shù)（定量）或ΔΔCt值（相對定量）等。

對于相對定量，軟件會自動計算實驗組相對于對照組的基因表達變化倍數(shù)。

4、導(dǎo)出數(shù)據(jù)

可以通過 “File" -> “Export" 將數(shù)據(jù)導(dǎo)出為Excel或CSV格式，用于進一步作圖或統(tǒng)計分析。

三、日常維護與注意事項

1、清潔：定期用柔軟的濕布擦拭儀器表面。如果發(fā)生污染，用70%乙醇擦拭樣品塊表面。

2、關(guān)機：通常不需要關(guān)閉儀器電源，保持待機狀態(tài)即可。如需長期不用，可關(guān)閉主機電源。

3、安全：在運行前后及取放板子時，注意樣品塊溫度可能很高，防止?fàn)C傷。

4、故障排查：如果遇到異常曲線（如起跳晚、信號弱、陰性對照有擴增），請從模板質(zhì)量、引物探針設(shè)計、反應(yīng)體系配制、污染等方面逐一排查。