使用賽默飛Simpliamp梯度PCR儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)所需的耗材和試劑。這是一套標(biāo)準(zhǔn)而完整的清單，您可以根據(jù)您的具體實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行選擇和調(diào)整。

一、賽默飛Simpliamp梯度PCR儀核心耗材

這些是直接放入PCR儀的消耗品。

1、PCR管或PCR板

（1）類型：必須使用透明、無(wú)裙邊或半裙邊的96孔PCR板或0.2ml單管/8聯(lián)管。Simpliamp的熱蓋是平板式設(shè)計(jì)，與平蓋的板/管才能緊密接觸，確保熱封效果。

（2）材質(zhì)：推薦使用高質(zhì)量、超薄壁的聚丙烯管/板，以確保熱傳導(dǎo)效率和溫度準(zhǔn)確性。

（3）重要提示：切勿使用有高高凸起管蓋的PCR管（如某些品牌的單管），否則熱蓋無(wú)法壓緊，會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)體系蒸發(fā)和實(shí)驗(yàn)失敗。

2、封板膜或管蓋

（1）對(duì)于PCR板：使用光學(xué)透明的粘性封板膜，確保密封嚴(yán)實(shí)，防止蒸發(fā)和交叉污染。

（2）對(duì)于單管/八聯(lián)管：確保管蓋蓋緊。八聯(lián)管通常有配套的平蓋。

二、賽默飛Simpliamp梯度PCR儀核心試劑

這些是構(gòu)成PCR反應(yīng)體系的化學(xué)成分。

1、PCR主混合物

（1）預(yù)混液：常用且方便的是 2× PCR Master Mix。它已經(jīng)包含了Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl?以及優(yōu)化的緩沖液。您只需加入模板、引物和水即可。賽默飛自家的 Platinum™ SuperFi™ PCR Master Mix 或 DreamTaq™ Hot Start PCR Master Mix 都是兼容性很好的選擇。

（2）單獨(dú)組分：也可以選擇單獨(dú)購(gòu)買：熱啟動(dòng)Taq DNA聚合酶、10× PCR緩沖液、dNTP混合物、MgCl?溶液。

2、引物

上游引物和下游引物：針對(duì)您目標(biāo)基因特異性設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物。通常使用濃度為10 μM的工作液。

3、模板DNA

可以是基因組DNA、cDNA、質(zhì)粒DNA等，濃度和純度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

4、無(wú)菌無(wú)核酸酶水

用于補(bǔ)足反應(yīng)體系體積。至關(guān)重要，必須確保無(wú)菌且無(wú)核酸酶污染，以防止降解和假陰性結(jié)果。

三、實(shí)驗(yàn)流程簡(jiǎn)要總結(jié)（以使用預(yù)混液為例）

1、在冰上配制反應(yīng)體系（以下為25μL體系的常見比例）：

2× PCR Master Mix：12.5 μL

上游引物（10 μM）：1.0 μL

下游引物（10 μM）：1.0 μL

模板DNA：X μL（通常10pg - 100ng，需優(yōu)化）

無(wú)菌無(wú)核酸酶水：補(bǔ)足至 25 μL

2、輕柔混勻并短暫離心，確保所有液體收集在管底。

3、將PCR管/板放入Simpliamp儀器中，確保放置平穩(wěn)。

4、在儀器控制面板或配套軟件上設(shè)置程序：

預(yù)變性：94-98°C，30秒 - 2分鐘。

循環(huán)（30-40次）：

變性：94-98°C，10-30秒。

退火：在此設(shè)置梯度溫度（例如50°C - 65°C），這是Simpliamp梯度功能的關(guān)鍵應(yīng)用，用于快速確定退火溫度。15-60秒。

延伸：72°C（對(duì)于Taq酶），每1kb延伸30-60秒。5-10分鐘。保溫：4-10°C。

5、啟動(dòng)運(yùn)行。

6、程序結(jié)束后，取出產(chǎn)物，進(jìn)行后續(xù)的電泳或分析。

梯度功能：Simpliamp的核心優(yōu)勢(shì)是可以在同一塊板/同一批管子上同時(shí)測(cè)試多個(gè)退火溫度。在設(shè)置時(shí)，您只需要在退火步驟設(shè)置一個(gè)溫度范圍，儀器會(huì)自動(dòng)在加熱塊的不同列生成線性梯度。放置樣品時(shí)，請(qǐng)根據(jù)儀器說(shuō)明書或屏幕提示，將樣品放在對(duì)應(yīng)的列上。

清潔與維護(hù)：定期用70%乙醇擦拭熱蓋和樣品槽，防止污染。